La síntesis del [[tetrahidrofolato]] se inicia a partir del [[Ácido 4-aminobenzoico|ácido p-aminobenzoico]].<ref>{{cita publicación |autor=Brumfitt W, Hamilton-Miller JM |título=Reassessment of the rationale for the combinations of sulphonamides with diaminopyrimidines | publicación=J Chemother |año=1993fecha |mes= diciembre de 1993 |volumen=5 |número=6 |páginas=465–9 |pmid=8195839}}</ref> Precisamente a este nivel actúa el sulfametoxazol, que bloquea la enzima responsable de la síntesis debido a su parecido estructural. Un paso posterior es la unión de dos moléculas de dihidrofolato en una sola de tetrahidrofolato. Es en este paso donde actúa la trimetoprima, ya que es análoga al dihidrofolato, por lo que bloquea la enzima responsable de la unión. Esta reacción tendría un efecto altamente tóxico en el ser humano, pero debido a que la afinidad de las bacterias por la trimetoprima es mucho más elevada que la de las células humanas, se pueden utilizar dosis lo suficientemente bajas para que no hagan daño al organismo humano mientras que son lo suficientemente altas como para interferir el metabolismo de las bacterias.
