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Dicroísmo circular
Usado por primera vez por Jean-Baptiste Biot, Augustin Fresnel y Aime Cotton, el dicroísmo circular (CD) hace referencia al diferencial de absorción entre la región derecha y la región izquierda de la luz circular polarizada. Este fenómeno se muestra en las bandas de absorción de las moléculas quirales ópticamente activas. La espectroscopia CD tiene un amplio rango de aplicaciones en múltiples campos. Sobresale UV CD el cual es usado para investigar la estructura secundaria de las proteínas. La UV/Vis CD es usada para investigar las transiciones de transferencia de carga. El CD infrarrojo es usado para la investigación geométrica y de estructura electrónica por medio de metales de transición d→d. El dicromismo circular vibracional. El cual emplea luz proveniente de la región de energía infrarroja es usada para estudios estructurales de moléculas de pequeños organismos, recientemente se a usado para el estudio de proteínas y ADN
PRINCIPIOS FISICOS
La radiación electromagnética consiste en un campo electromagnético el cual oscila perpendicularmente el uno del otro y en dirección de propagación. La luz polarizada se genera cuando el vector del campo eléctrico oscila en un único plano y magnitud, la luz polarizada circular se genera cuando le vector del campo eléctrico rota sobre su eje de propagación y mantiene una magnitud constante. De esto anterior se forma una hélice en el espacio cuando se propaga. Para la región izquierda de la luz polarizada (LCP) con propagación hacia el observador, el vector eléctrico rota en sentido contrario a las manecillas del reloj. Para la región derecha de la luz polarizada (RCP) el vector eléctrico gira en el mismo sentido de las manecillas del reloj
INTERACCION DE LA LUZ CIRCULAR POLARIZADA CON LA MATERIA
Cuando la luz circular polarizada pasa a través de un medio de absorbencia óptica activo, la velocidad entre la polarización derecha e izquierda difiere (cL ≠ cR) al igual que sus longitudes de onda (λL ≠ λR) y el grado en el que son absorbidos (εL≠εR). Dicroísmo circular es Δε ≡ εL- εR. El campo eléctrico del haz de luz genera un desplazamiento lineal de cargas cuando interactúa con la molécula (dipolo eléctrico), donde el campo magnético causa una circulación de la carga (dipolo magnético). Estos dos movimientos causan una excitación en el electrón en un movimiento helicoidal, el cual incluye translación y rotación y sus operaciones asociadas. La relación experimental entre la fuerza de rotación (R) de la muestra y el Δε es dado por:
La fuerza rotacional ha sido determinada teóricamente,
Podemos ver en esas dos ecuación que Δε no es igual a cero, los vectores del dipolo magnético y eléctrico y deben transformaren como la misma representación irreducible. Cn y Dn son los únicos puntos donde esto puede ocurrir, haciendo activar solo las moléculas kirales CD.
Simplemente puesto, ya que la luz circular polarizada es a si misma quiral, interactúa de manera diferente con las moléculas quirales. Es decir, lo dos tipos de luz circular polarizada son absorbidos a diferentes niveles. En experimento de CD, cantidades iguales de luz circular polarizada derecha e izquierda de una longitud de onda seleccionada son irradiadas de manera alternada en una (quiral) muestra, una de las dos polarizaciones es absorbida más que la otra, y esta diferencia de longitud de onda de absorción es medida, dando el espectro de CD de la muestra. Debido a la interacción con la molécula, el vector del campo eléctrico de la luz traza una forma elíptica hacia afuera después de pasar a través de la muestra
DELTA DE ABSORBANCIA
Por deficinicion:
Donde ΔA es la diferencia entre absorbencia de la luz polarizada circular derecha (LCP) y la luz polarizada circular izquierda (esta es siempre medida). ΔA es una función de longitud de onda. Para una medida es importante saber la longitud de onda en la cual fue realizado.
También puede ser expresado mediante la aplicación de la ley de Beer’s
Donde εL y εR son los coeficientes molares para LCP y RCP
C es la concentración molar y l es la longitud en Cm
Entonces
Es Esta propiedad intrínseca el dicroísmo circular que por lo general quiere decir que de la sustancia. Si Δε es la función de longitud de onda, un valor de dicroísmo circular (Δε) debe especificar la longitud de onda en la cual es valido.
EFECTOS EXTRINSECOS DEL DICROÍSMO CIRCULAR
En muchas aplicaciones practicas del dicroísmo circular (CD), como lo discutimos anteriormente, la medida del CD no es simplemente una propiedad intrínseca de la molécula, pero sin embargo depende de la conformación molecular. En un caso dado, el CD también puede ser una función de temperatura, concentración o del entorno químico, incluyendo solventes. En este caso el valor Cd debe especificar los demás factores relevantes.
ELEPTICIDAD MOLAR
Aunque ΔA es normalmente medido, por razones históricas la mayoría de las mediciones son reportados en grados de elipticidad. Dicroísmo circular molar y elipticidad molar, [θ], son fácilmente convertibles por la ecuación:
Esta relación es derivada por medio de la definición de polarización de la elipticidad:
Donde: ER y EL son magnitudes de los vectores del campo eléctrico de la circularidad derecha y la circularidad izquierda de la luz polarizada respectivamente
Cuando ER es igual a EL (cuando no hay diferencia en la absorción de la luz polarizada derecha e izquierda circular), θ es 0 ° y la luz está polarizada linealmente. Cuando cualquiera de las ER o EL es igual a cero (cuando es completa absorción de la luz polarizada circular en una dirección), θ es de 45 ° y la luz se encontrara polarizada circularmente.
En general, el efecto de dicroísmo circular es pequeño, por lo que tanθ es pequeño y se puede aproximar como θ en radianes. Dado que la intensidad o irradiación, I, de la luz es proporcional al cuadrado del vector de campo eléctrico, la elipticidad se convierte en:
A continuación, mediante la sustitución de I usando la ley de Beer en forma de logaritmo natural:
La elipticidad ahora se puede escribir como:
Desde Δ.A <<1, esta expresión se puede aproximar mediante la ampliación de las exponenciales en serie de Taylor de primer orden y luego descartar términos de Δ.A en comparación con la unidad y la conversión de radianes a grados
La dependencia lineal de la concentración de solutos y la longitud del camino se elimina mediante la definición de elipticidad molar,
Entonces la combinación de las dos últimas expresiones con la ley de Beer, elipticidad molar se convierte en:
LA MEDIA DE RESIDUOS DE ELITICIDAD
Métodos para estimar la estructura secundaria en los polímeros, proteínas y polipéptidos, en particular, requieren a menudo que el espectro medido elipticidad molar se convierte en un valor normalizado, en concreto un valor independiente de la longitud del polímero. elipticidad media de residuos se utiliza para este fin, es simplemente la elipticidad medida molar de la molécula dividida por el número de unidades monoméricas (residuos) de la molécula.
APLICACIÓN A LAS MOLÉCULAS BIOLOGICAS
En general, este fenómeno se exhibe en las bandas de absorción de una molécula ópticamente activa. Como consecuencia, dicroísmo circular se muestra en las moléculas biológicas, debido a sus componentes y dextrorotary levorotary. Aún más importante es que la estructura secundaria también se impartirá un CD distinto a sus respectivas moléculas. Por lo tanto, la hélice alfa de las proteínas y la doble hélice de los ácidos nucleicos representante CD firmas espectrales de sus estructuras. La capacidad de CD para dar una firma estructural representante convierte en una herramienta poderosa en la bioquímica moderna con las aplicaciones que se pueden encontrar en prácticamente todos los campos de estudio.
CD está estrechamente relacionado con la dispersión óptica rotatoria (ORD), la técnica, y generalmente se consideran más avanzadas. CD se mide en o cerca de las bandas de absorción de la molécula de interés, mientras que DRP se puede medir muy lejos de estas bandas. Ventaja del CD se puede comprobar en el análisis de datos. Los elementos estructurales son más claramente distinguido desde sus bandas grabadas no se superponen ampliamente en longitudes de onda particular, como lo hacen en ORD. En principio, estas dos mediciones espectrales pueden ser interconvertibles a través de un integrante de transformación (Kramers-Kronig relación), si todas las absorciones se incluyen en las mediciones.
La medida-UV (ultravioleta) del espectro de CD de proteínas puede revelar características importantes de su estructura secundaria. Espectros de CD puede ser fácilmente utilizada para estimar la fracción de una molécula que se encuentra en la conformación del alfa-hélice, la conformación beta-hoja, la conformación beta-a su vez, o alguna otra conformación (por ejemplo, la bobina al azar). Estas asignaciones fraccionada imponen limitaciones importantes en la conformación secundaria posible que la proteína puede estar adentro de CD no puede, en general, por ejemplo, donde las hélices alfa que se detectan se encuentran dentro de la molécula o incluso completamente predecir cuántos hay. A pesar de ello, el CD es una herramienta valiosa, especialmente para mostrar cambios en su conformación. Puede, por ejemplo, ser usado para estudiar cómo la estructura secundaria de una molécula de cambios en función de la temperatura o la concentración de agentes desnaturalizantes, por ejemplo, Clorhidrato de guanidinio o urea. De esta manera, pueden revelar información importante acerca de termodinámica de la molécula (por ejemplo, la entalpía y la energía libre de Gibbs de desnaturalización) que de otro modo no se puede obtener fácilmente. Cualquiera que intente estudiar una proteína que se encuentra un CD valiosa herramienta para comprobar que la proteína se encuentra en su conformación nativa antes de realizar extensas y / o experimentos de cara con él. Además, hay una serie de otros usos para la espectroscopia de CD en química de proteínas no relacionadas con la estimación de la fracción alfa-hélice.
El espectro cercano ultravioleta CD (> 250 nm) de las proteínas proporciona información sobre la estructura terciaria. Las señales obtenidas en la región de 250 a 300 nm se debe a la absorción, la orientación del dipolo y la naturaleza del entorno de la fenilalanina, tirosina, cisteína (o puentes disulfuro SS) y los aminoácidos triptófano. Al contrario que en la medida de CD-UV, el espectro cercano ultravioleta CD no pueden ser asignados a cualquier estructura 3D en particular. Más bien, cerca de los espectros UV-CD proporcionar información estructural sobre la naturaleza de los grupos de prótesis en las proteínas, por ejemplo, los grupos hemo de la hemoglobina y el citocromo c.
Visible CD espectroscopia es una técnica muy poderosa para estudiar las interacciones proteína-metal y pueden resolver cada transiciones dd electrónico como bandas separadas. espectros de CD en la región de luz visible sólo se produce cuando un ion metálico se encuentra en un entorno quiral, por lo tanto, los iones libres de metales en solución no se detectan. Esto tiene la ventaja de sólo observar el metal unido a las proteínas, por lo que la dependencia del pH y la estequiometria se obtienen fácilmente. La actividad óptica en los complejos de iones metálicos de transición se han atribuido a los efectos de configuración, conformación y vecinales de la. Klewpatinond y Vilela (2007) han producido un conjunto de reglas empíricas para predecir la aparición de los espectros de CD visibles para los complejos cuadrados planos Cu2 y Ni2 participación de histidina y la coordinación principal de la cadena.
CD proporciona información estructural menos específica que la cristalografía de rayos X y espectroscopia de RMN de proteínas, por ejemplo, que ambos dan datos atómicos resolución. Sin embargo, la espectroscopia de CD es un método rápido que no requiere grandes cantidades de proteínas o de procesamiento de datos extensa. De este modo CD puede ser utilizado para estudiar un gran número de condiciones de disolvente, variando la temperatura, el pH, la salinidad y la presencia de varios cofactores.
CD espectroscopia se utiliza generalmente para estudiar las proteínas en solución, por lo que complementa los métodos que estudian el estado sólido. Esta es también una limitación, ya que muchas proteínas están incrustadas en las membranas en su estado natal, y soluciones que contienen estructuras de membrana son a menudo muy dispersas. CD a veces se mide en películas delgadas.
LIMITACIONES EXPERIMENTALES
CD también ha sido estudiado en hidratos de carbono, pero con éxito limitado debido a las dificultades experimentales asociadas a la medición de los espectros de CD en el ultravioleta de vacío (VUV) región del espectro (100-200 nm), donde las bandas de CD correspondiente de los hidratos de carbono no sustituido mentira. Hidratos de carbono sustituido con bandas por encima de la región VUV han medido correctamente.
Medición de CD también se complica por el hecho de que los típicos sistemas de tampón acuoso a menudo se absorben en el rango donde presentan características estructurales de absorción diferencial de la luz polarizada circularmente. Fosfato, sulfato, carbonato, y tampones de acetato son generalmente incompatibles con el CD menos que se haga extremadamente diluidas por ejemplo, en el rango de 10-50 mm. El sistema de TRIS, debe evitarse por completo cuando se realiza la medida de CD-UV. Compuestos Onio borato y se utilizan a menudo para establecer el intervalo de pH apropiado para experimentos de CD. Algunos experimentadores han sustituido fluoruro de iones de cloruro de flúor porque absorbe menos en la UV el momento, y algunos han trabajado en agua pura. Otra, casi universal, la técnica es minimizar la absorción de disolvente utilizando células longitud del camino más corto cuando se trabaja en la UV el momento, 0,1 mm longitud de la ruta no son poco comunes en este trabajo.
Además de medir en sistemas acuosos, CD, sobre todo ahora-UV de CD, se puede medir en disolventes orgánicos, por ejemplo, etanol, metanol, trifluoroetanol (TFE). Este último tiene la ventaja de inducir la formación de estructuras de proteínas, la inducción de beta-hojas en las hélices alfa en unos y otros, que no muestran en condiciones normales acuosa. La mayoría de los solventes orgánicos comunes, tales como acetonitrilo, tetrahidrofurano, cloroformo, diclorometano son, sin embargo, incompatibles con la medida de CD-UV.
Puede ser de interés observar que los espectros de CD de proteína utilizada en la estimación de la estructura secundaria están relacionados con el π a π * absorciones orbitales de los enlaces amida que une los aminoácidos. Estas bandas de absorción se encuentran en parte en el ultravioleta de vacío llamado (longitudes de onda inferior a 200 nm). La región de longitud de onda de interés en realidad es inaccesible en el aire debido a la fuerte absorción de luz por el oxígeno en estas longitudes de onda. En la práctica estos espectros no se miden en el vacío sino en un instrumento libre de oxígeno (llena de gas nitrógeno puro).
Una vez que el oxígeno se ha eliminado, tal vez el factor técnico de segundo más importante en el trabajo por debajo de 200 nm es diseñar el resto del sistema óptico de tener bajas pérdidas en esta región. Crítica en este sentido es el uso de espejos de aluminio, cuyo revestimiento se han optimizado para la pérdida de baja en esta región del espectro.
La fuente habitual de luz en estos instrumentos es de una alta presión, lámpara de xenón de arco corto. Lámparas de arco de xenón ordinario no son adecuadas para su uso en la UV de baja. En cambio, la lámpara especialmente construida con los sobres hechos de gran pureza de sílice sintética fundida debe ser utilizada.
La luz de fuentes de radiación sincrotrón tiene un flujo mucho mayor en longitudes de onda corta, y se ha utilizado para grabar CD de hasta 160 nm. Recientemente, el espectrómetro de CD en el centro del anillo de almacenamiento de electrones de ISA en la Universidad de Aarhus en Dinamarca se utiliza para registrar espectros de sólidos CD estado a 120 nm. En el ámbito de la mecánica cuántica, el contenido informativo de dicroísmo circular y rotatorio se idénticos.
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