Isabel esta en dialogación para unirse en matrimonio con la corona francesa, el pueblo clama la condena de María, escucha consejos sobre su decisión con respecto a la sentencia. Se presenta Paulet y le entrega la carta de María Estuardo, la conmueve ésta pero no se decidió aceptar sino hasta que escuchó la elocuencia del conde Leicester, que veía por el beneficio de María. Leicester mantenía una relación estrecha con Isabel y era su preferido, pero una ofensa pasada hacia el amor de María Esturdo le infundía sentirse en deuda y para expiarse cambiaba, pero no sacrificaría su posición. Mortimer se confió a él y le exhorto a unirse a su empresa temeraria, de liberar a Esturdo por la fuerza, pero no convinieron. Isabel quería muerta a María pero no iba macular sus manos, por lo que confiando en la juventud y lealtad de Mortimer le encomendo el regicidio tácitamente.
La entrevista de entre Isabel y María, termino por aumentar la hostilidad, cuando Isabel sale a las calles de vuelta y es víctima de la [[conspiración de Ridolfi]], es culpada a María y en la obra es explicado como una indisciplina por parte de uno de los confabulados que organizo Mortimer, él a pesar del peligro se queda aun con el anhelo de liberarla, se revela y admite su verdadera naturaleza ante María, le confiesa su amor pasional, y su ambición de poseerla. Mortimer se inmola antes de ser detenido. Isabel decide que se ejecute a María el día siguiente, le entrega la orden a un delegado sin darle ordenes explicitas de su voluntad. El conde Leicester es sospechoso en el intento de su asesinato, tras encontrar pruebas de las relaciones con traidora en las posesiones de María. El conde cohonesto su perfidia y fue perdonado, pero a condición de hacer cumplir la sentencia, para probar que su relación con María es inexistente y solo era intriga del enemigo. El barón de Burleigh le quita al secretario la orden y la ejecuta, por lo que la reina se desentiende de su culpabilidad en la muerte de María. Tras su muerte el conde de Leicester deja Inglaterra, el conde Shrewsbury dimite ante la reina, y ella se queda solo en la escena.
