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[[Carlos I de España|Carlos de Habsburgo]], quien había nacido en [[Gante]], volvió a otorgar a Bruselas como la sede del [[Brabante Flamenco]] y los consejos de gobierno comenzaron a realizarse allí.<ref>{{Cita web| url = http://www.brussels.org/history/ | título = History of Brussels | obra = brussels.org | fechaacceso = 15/05/2008 | idioma = inglés}}</ref> Esto atrajo inmigrantes a la ciudad que por primera vez supera la importancia de otras ciudades como [[Lovaina]], [[Amberes]] y [[Malinas]].
 
Carlos persiguió a los protestantes desde el comienzo en esta región. El 1 de julio de 1523 fueron ejecutados los monjes agustidos Henricus Vos y Johannes van den Esschen. Estos se convirtieron en los primeros protestantes en ser ejecutados después de que [[LuterLutero]] colocase sus tesis en la puerta de Wittenberg.
 
En 1556 se celebró la ceremonia de [[Carlos I de España#Abdicación y herencia de Carlos V|abdicación de Carlos de Habsburgo]] en el Aula Magna del Palacio de Coudenberg. La inquisición española hacía estragos en los Países Bajos. Eso motivó a que unos doscientos nobles de la región marcharan en 1566 ante el palacio de Margarita de Parma para pedir que se terminase la inquisición en la zona. Felipe II, que tenía a sus soldados concentrados en la guerra contra los turcos en el Mediterráneo, mandó a declarar que aceptaba la petición, pero solo lo hacía porque había sido obligado a ello.